無菌檢測儀不（bú）使用集菌儀和使用集菌儀的（de）差別

　　OOS(outofspecification,超限（xiàn）度、超規格)結果，是指產品質量指標測試中超出已經（jīng）建立的可（kě）接受標準的（de）單個或一係列結果。無菌產品的陽性結果、微生物限度試驗超出（chū）行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標準等均（jun1）為（wéi）OOS結果《中國（guó）藥典》2015年版m和新版《藥品生產質量管理規範（fàn）》（GMP)增加了OOS調查章節，對微（wēi）生物實驗室00S結（jié）果的調查做（zuò）出了較為詳細的闡述和（hé）實例分析，要求任何OOS結果必須按照書麵規程進行完整的調查。因為隻有確（què）定了OOS結果產生的原因並判定其是否有效，進而才能製訂完（wán）善的預防和整改措施，以保證檢驗結果的準確性。因此，實驗室（shì）建立OOS調查處理程序，對OOS結果進行科學、及時、有效的調查分析處理是（shì）十分必要的微生物在自然環境中無處不在，並可能會（huì）隨檢驗人員、檢驗用（yòng）器材以及檢品的包（bāo）裝容器進入檢（jiǎn）驗環境。因此，關於微生物檢驗中藥品的無菌檢査（chá）項（xiàng）目（mù），新版藥典對其（qí）操（cāo）作環境提出了更高要求，新版GMP也加強了對無（wú）菌操作環境空氣微生物、表麵微生（shēng）物以及人員手套和操作服表麵微生（shēng）物的監測頻（pín）率（lǜ），並做出了明確規（guī）定。而對於（yú）無菌檢査OOS結果的調査，需核實（shí）的相關記錄和影響因（yīn）素（sù）更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調查須追（zhuī）溯到（dào）實驗過程的（de）每一個環節，而對於它的變異性，調查過（guò）程又需針對不同（tóng）的OOS結果著（zhe）重分析調查相應的不同環節。

　　對（duì）於微生物實驗室（shì）OOS的調查，局限於每個檢（jiǎn）驗（yàn）單位的技術水平和資源，同樣限於人類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS調査都可以發現其根本（běn）原因，但通過此調査過程仍能（néng）夠幫助調查者找出超標結果發生的可能原因並進而（ér）采取糾正預防措施，基（jī）於風險分析，對相關批次產品做出最後處理（lǐ）決定'從而降低藥品質量風險，既是保（bǎo）證藥品質量的（de）重要（yào）工作，又是質量體係持續改進的原動力。本文通過對4批無菌產品的無菌檢査實驗（yàn）全過程的（de）回顧性分析和調查，探索導致（zhì）無菌實驗OOS結果的（de）明確原因，以期建立微生物實驗室完善的（de）OOS調（diào）査方案。

　　1、材（cái）料、儀器與試劑

　　全自動智能無菌集菌儀(上海秉越zw-2008)一次性使用全封閉集菌培養器顯（xiǎn）微鏡AxiosescopeA

　　全自動微生物鑒定儀

　　酵母菌鑒定卡

　　無菌檢查樣品為（wéi）4個批號的注射用頭孢噻膀鈉。

　　2、方法與結果

　　2.1實驗（yàn）方法

　　2.1.1藥品的無菌檢查

　　依（yī）照《中國藥典（diǎn）》2010年版_檢驗注（zhù）射（shè）用頭孢噻（sāi）肟鈉的無菌檢查項目。

　　2.1.2鏡檢及鑒定

　　取陽性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按照儀器及試劑的使用說明，對經過純化的微生物進行革蘭氏染色，確定微生物形態，然後根據形態選擇鑒定卡，使（shǐ）用全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact進（jìn）行鑒定。

　　2.2結果

　　4個（gè）批號的注射用頭孢噻（sāi）肟鈉的無菌檢查檢驗結果如表（biǎo）1所示：2號和4號樣品（pǐn）改良馬丁（dīng）培（péi）養基均在第3天變渾濁（zhuó）。取改良馬丁（dīng）培養液劃線TSA平板（bǎn），30~35℃培養（yǎng）48h，平板上（shàng）呈現白色、光滑、邊（biān）緣整齊、形態單一的菌落。

　　革蘭氏染（rǎn）色鏡檢結果為酵（jiào）母菌。經全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均（jun1）為季也蒙假絲酵母（mǔ）。

　　3、OOS結果的調查和分析

　　依據新版GMP對OOS調查的要求，回顧性（xìng）分（fèn）析調查注射（shè）用頭（tóu）孢噻肟鈉無菌（jun1）檢查OOS結果產生的原因。

　　①日常監控和（hé）驗收記錄：

　　培養基的驗收記錄、培養基的製備和滅菌記錄、檢驗器具準（zhǔn）備和（hé）滅菌（jun1）記錄、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔淨室清潔消毒記錄、檢驗員使用潔淨服的（de）滅菌記（jì）錄（lù）和使用記錄、無菌檢（jiǎn）驗操作記錄以及環境監控記錄等均未發現異常。

　　②人員：

　　甲和乙實驗人員均能熟練掌握（wò）無菌檢驗的流程（chéng）、監（jiān）控要點和（hé）無菌操作規範。

　　③樣品：

　　確認樣品的編號和批號無誤，無菌檢（jiǎn）査取（qǔ）樣前，樣品（pǐn）西林（lín）瓶外觀正常，西林瓶蓋並未發現鬆（sōng）動的跡（jì）象。

　　④實驗器具：

　　實驗中使用的py330集菌器、一次件使用無菌注射器以及一次（cì）性使（shǐ）用（yòng）無菌手套的無菌驗收均符合規定，且用於當天其他檢（jiǎn）品的檢驗，並未發現汙染情（qíng）況。

　　⑤培養基及衝洗液和稀釋液（yè）：

　　無（wú）菌檢查用培養基的陰性對（duì）照均（jun1）符合規定，且同批製備和滅菌的培養基用於同日檢（jiǎn）查的其他檢（jiǎn）品，並未發現汙染情況。

　　⑥檢驗環境：

　　現場環（huán）境監（jiān）控的3皿沉降（jiàng）菌監測的TSA平皿均未有菌落生長，並未出現汙染情況。定期環境檢測（cè）表麵菌符合規定，樣品無菌檢查當日（rì）潔淨空調係統（tǒng）均運行正（zhèng）常。

　　⑦不同（tóng）檢驗體係對結果判定（dìng）造成的影響：

　　由於現行《中國藥典》無菌檢查使用（yòng）的改良馬丁培養基不（bú）同於國際標準使用的TSB,將改（gǎi）良馬丁（dīng）培（péi）養物劃線TSA平板上長出的（de）菌落（luò）接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象。因此可以排除因檢（jiǎn）驗體（tǐ）係不同造成的實驗結果偏差。

　　⑧菌株：

　　樣品檢出菌經鑒定為季也蒙假絲酵（jiào）母菌，比對曰常潔淨室監控收集的菌株（zhū）建立的菌庫，潔淨室中從未監測到此種菌株。

　　⑨附加實驗的結果與分析：

　　通過以上分析，初步認定無菌不合格為實驗有效結果。但鑒於此次無菌檢驗過程（chéng）並未嚴格（gé）按照新版GMP和《中（zhōng）國藥典》2015年版規定的對檢驗環境和（hé）人員的全麵監（jiān）控，環境和人員帶來的汙染仍（réng）有造（zào）成OOS結果的可能性，附加實驗就是對檢驗環境進行全麵（miàn）監測。

　　現場環境監控按照新（xīn）版GMP的要求實（shí）施，並增加對潔淨室回風口浮遊菌的（de）監測，監測（cè）結果均（jun1）符合規定。微生物監測方麵，除實驗人員無菌服（fú）胸口處采集到一個菌落，其他均未有菌落生長。實驗人員無（wú）菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種（zhǒng）曾在日常潔淨室監控中不止（zhǐ）一次檢出過，並未對樣品產生過（guò）汙染。

　　4、結論與（yǔ）討論

　　OOS結（jié）果表明，並未在實驗室發現導致OOS結果的明確原（yuán）因，檢出菌也並非由於（yú）實驗室檢驗過程帶來的汙染，懷疑樣品本身被季也蒙假絲酵母菌所汙染，從（cóng）而導致無菌檢查的（de）陽性結果。

　　通過對上述OOS的調查和分析，初（chū）步建立了微生物實驗（yàn）室OOS結果調查的分析方案，分別（bié）從人、機、料、法、環（huán）5個方麵進行闡述：

　　人——實（shí）驗人員。考察人員是否經過相關檢驗的培訓和考核，是否了解該項檢驗的流程和監控要點。無菌區全體人員每年應進行一次再培訓和資格的再確認，對（duì）無（wú）菌區人（rén）員操作服（fú）和手套（tào）表麵的微生物監測嚴格（gé）按新版GMP執行；

　　機——實驗中（zhōng）使用的儀器設備。檢查（chá）集菌儀等（děng）儀器近期使（shǐ）用記錄是否發現（xiàn）異常，參數設置是否（fǒu）正確。儀器的計（jì）量和（hé）校準均需在有（yǒu）效期內，無菌區內使用的儀器需定期消毒並定期進行微生物的（de）表麵監測，使用的器具需經滅菌消毒，一次性使用器具需經質量驗收（shōu）；

　　料——樣品、培養基、稀釋液和衝洗液。檢查剩餘樣品的編號（hào）和批號（hào）是否準確，樣品的外觀是否異（yì）常，瓶蓋（gài）是否有鬆脫（tuō）現象以及樣（yàng）品的前期存放條件（jiàn）和取樣方式是（shì）否合理。必要時，對樣品的瓶蓋和瓶口（kǒu）等（děng）關鍵部位擦抹取樣，培養觀察；

　　檢（jiǎn）查培養基質量驗收記錄和配製記錄，確認配製和滅（miè）菌是否（fǒu）合理有效，是否用於其他樣（yàng）品的檢驗，培養基、稀釋液和衝洗液的（de）陰性對照應符合規定；

　　法（fǎ）——檢驗方法和依（yī）據。實驗所用（yòng）標準應符合設定實驗和檢（jiǎn）驗依據的（de）要求（qiú）；

　　環——實驗環境。檢查潔淨空調係統（tǒng）是否運行正（zhèng）常，監測記錄包括定期監控記錄和實驗現場環境監控記錄，是否符合潔淨度要（yào）求，清潔記錄顯示是否按時清潔，消毒液是（shì）否使（shǐ）用合理。另（lìng）外（wài），未確定OOS結果產生的明確原因時，不能急於對環境進行消毒（dú）處理，以免忽略了可能的環境汙染因素。

　　微（wēi）生物負（fù）荷和實驗檢出（chū）菌的比對分析。實驗室的微生物負荷，包括潔（jié）淨室的空氣微生物、表麵微生（shēng）物和人員操（cāo）作服及手（shǒu）套的表麵微生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效鑒別和分析，建立潔淨室生物負載數據庫，可（kě）為微生（shēng）物（wù）OOS調査提供數據（jù）基礎。

　　對檢出菌進（jìn）行鑒定，分析（xī）監控收集（jí）的微生物分布和鑒定與陽性結果的相關性（xìng），當發現與陽性菌株相近的菌株時，可利用分子生物（wù）學方法比對陽（yáng）性菌株與微（wēi）生物負荷的同源性，為陽性菌的汙染溯源提（tí）供依據。

　　此外，對不同實驗（yàn）會產生不同的OOS結果（guǒ），可針（zhēn）對某些相關環節靈活考察。例如（rú），針對（duì）不同的微生（shēng）物，采用不同的（de）監測手段，陽性檢出菌為酵母菌時，增加沙（shā）氏葡萄糖瓊脂用（yòng）於（yú）環境監控的附加實驗，則能夠更好地確認環境中的該類微生物。

　　需要（yào）著（zhe）重強調的是（shì），檢（jiǎn）出菌的鑒別對於OOS結（jié）果的調查非（fēi）常關鍵，決定最後是否可以發現根本原（yuán）因，應該給予足夠重視。

　　綜上所述，微生物相關檢驗項目OOS結果的調查工作量很大，且專（zhuān）業性強，實驗（yàn）室不僅需要具備受過良好培訓和具有豐富檢驗經驗的工作人員，還需建立完善的OOS調查方案來規範調查操作。