微生物純培養與生長量測定

　　一、微生物純培養技術

　　微生物在自然界中不僅分布（bù）廣，而且種類多，並（bìng）多是混（hún）雜地生活在一起。要想研究或利用某一（yī）微生物，必須把混雜的（de）微（wēi）生物（wù）類（lèi）群分離開來，以得到隻含一（yī）種微生物的純培養（yǎng）。微生物學中將在實驗室（shì）條件下由一個細胞或一種細胞群繁殖得到（dào）的後代稱為微生（shēng）物（wù）的純培養。

　　純培養技術包括兩個基本步（bù）驟：①從自然環境中分離培養對象。②在以培養對象為唯一生物種類的隔離環境中培（péi）養、增殖，獲得這一生物種類的細胞群體。針對不同（tóng）微生物的特點，有許多分離方法。應用最廣（guǎng）的是平板（bǎn）法分離純（chún）培養。

　　（一）、用固體培養基分離純培養

　　單個微生物在適宜（yí）的（de）固（gù）體培養基表麵或內部（bù）生（shēng）長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的（de）、有一定形態結構的（de）子（zǐ）細胞生長群體，稱為菌落（colony）。當固體培養基表麵眾多（duō）菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生（shēng）物在特定培養基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征，可以成為對該微生物進行分（fèn）類、鑒定的重要依據。大多數細菌、酵母（mǔ）菌（jun1）、以及許（xǔ）多真（zhēn）菌和單細胞藻（zǎo）類能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平（píng）板，即培養平板（culture plate）的簡稱，它是指固體培養基倒入無菌平皿，冷卻凝固後，盛固體培養基的平（píng）皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養基表麵或裏麵。固（gù）體培養基用瓊脂或其它凝膠（jiāo）物質固化的（de）培養基，每個（gè）孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成（chéng）的菌落便（biàn）於移植。最常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固（gù）體培養（yǎng）基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。

　　1.稀（xī）釋倒（dǎo）平板法（pour plate method）

　　先將待分離的材料用無菌水作一係列的稀（xī）釋（shì）（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然後分別取（qǔ）不同（tóng）稀釋液少許，與已熔化並冷卻至（zhì）50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻後，傾入滅過（guò）菌的培養皿中（zhōng），待瓊脂（zhī）凝固後，製成可能含菌（jun1）的瓊脂平板（bǎn），保溫培養（yǎng）一（yī）定時間即（jí）可出現菌（jun1）落（luò）。如果（guǒ）稀釋得當，在平板表（biǎo）麵或瓊脂培養基中（zhōng）就可出現分散的單個菌落，這個菌落（luò）可能就是（shì）由一個細菌細胞繁殖形成的（de）。隨後挑（tiāo）取該單個菌落，或重複以上（shàng）操作數次，便可得到純培養。

　　2.塗布平板法（spread plate method）

　　由於將含菌材料先加到還較燙的培養基中再倒平板易造成某些（xiē）熱敏感菌的死（sǐ）亡，而且采用稀（xī）釋（shì）倒平板法也會使一些（xiē）嚴格（gé）好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏（fá）氧氣而影響其生長，因此在微生（shēng）物學研究中更常用的純種分離方法是塗布平板法。其做法是先將已熔化的培（péi）養基倒入無菌平皿，製成無（wú）菌（jun1）平板，冷卻凝固後，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表麵，再用無菌玻璃（lí）塗棒將菌液均勻分散至整個平板表麵，經培養後挑取單個菌落（圖2-4）。

　　3.平板劃線法（streak plate method）

　　用接種環以無菌操作沾（zhān）取少許待分離的材料，在無（wú）菌平板表麵進行平行劃線、扇形劃線或其（qí）他（tā）形式的連續劃線，微生物細胞數量（liàng）將隨（suí）著劃線次數的增加而（ér）減少，並逐（zhú）步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一（yī）一分散（sàn），經培養後（hòu），可在平（píng）板表麵得到單菌落。

　　4.稀釋（shì）搖管法（dilution shake culture method）

　　用固體培養基（jī）分離（lí）嚴（yán）格厭氧菌有它特殊的地方。如果該（gāi）微生物暴露於（yú）空氣中不立即死亡，可以采用通常的（de）方法製備平板，然後置放在封閉的容（róng）器中培養，容器中的氧（yǎng）氣可采用化（huà）學、物理（lǐ）或生物的方法清除。對於那些對氧（yǎng）氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進行，它是（shì）稀（xī）釋倒平板法的一種變通形式。先將一係列盛無菌瓊脂培養基的試管加（jiā）熱使瓊脂熔化後冷卻（què）並保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管（guǎn）進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂柱表麵（miàn）傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石（shí）蠟的混合物，將培養（yǎng）基和空氣隔開。培養後，菌落（luò）形成（chéng）在瓊脂柱（zhù）的中間。進（jìn）行單菌落的挑（tiāo）取和移植，需先用一隻滅菌針將液體石蠟--石（shí）蠟蓋取出，再用一隻毛（máo）細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置（zhì）放在培養（yǎng）皿中，用無菌（jun1）刀將瓊脂柱（zhù）切成（chéng）薄片進行觀察和（hé）菌落的移植。

　　（二）、用（yòng）液體培養基分（fèn）離（lí）純培養

　　對於大多數細菌和真菌（jun1），用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數（shù）種（zhǒng）類在（zài）固體培養（yǎng）基上長得很好。然而迄今（jīn）為（wéi）止並不是所有的微生物都能在固體培養基（jī）上生（shēng）長，例如一些細胞大的細菌、許多（duō）原生動物和藻類等，這些微（wēi）生物仍需要用液體（tǐ）培（péi）養基分離來獲得純培養。

　　通（tōng）常采用的液體培養基分離純化法是（shì）稀釋法。接種物在液體培養基中進行順序稀釋（shì），以得到高度稀釋的效（xiào）果，使一支試管中（zhōng）分配不到一個微生物。如果經稀釋後的大多數試管中沒有微生物生長，那麽有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經稀（xī）釋後的（de）試（shì）管中有微生物生長（zhǎng）的比（bǐ）例提高（gāo）了（le），得到純培養物的機率就會急劇下降。因（yīn）此，采用稀釋法（fǎ）進行（háng）液體分離，必須在同一個稀釋（shì）度的許（xǔ）多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現為不生長。

　　（三）、單細胞（孢子）分離

　　稀釋法有一個重要缺點，它隻能分離出混雜微生物群（qún）體中占數（shù）量優勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜（zá）群體中都是少數。這時，可以采取顯微分離法從混雜群（qún）體中直接分離（lí）單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養，稱為單（dān）細胞（bāo）（或單孢（bāo）子）分離法（fǎ）。單細胞分離（lí）法的難度與細胞或個體的大小成（chéng）反比，較大的（de）微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的（de）細菌則較難。

　　對於較大的微生物，可采（cǎi）用毛細管提取（qǔ）單個個體，並在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾（jǐ）次（cì），除去較小微生物的汙染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對（duì）於個體相對較（jiào）小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯（xiǎn）微鏡下進行。目前，市場上有售（shòu）的顯微操作儀種類很多，一般是通過（guò）機械、空氣或油壓傳動裝（zhuāng）置來減小手的動作幅度，在顯微鏡（jìng）下用（yòng）毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單（dān）個微生物細胞或孢子以獲（huò）得純培（péi）養。在沒有顯微操作儀（yí）時（shí），也可（kě）采用一些變通的方法（fǎ）在顯微鏡下進（jìn）行單細胞分離，例如將經適（shì）當稀釋後的樣（yàng）品製備成小液滴在顯微鏡下（xià）觀察，選取隻含一個（gè）細胞的液（yè）體來進行純培（péi）養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限於高度專業化的科學研究中采用。

　　（四）、選擇（zé）培養分離

　　沒有（yǒu）一種培養基或一種培養條件能（néng）夠滿足自然界中一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。在一（yī）種培養基上接種多種微生物，隻（zhī）有能生長的才生長，其它被抑製。如果某（mǒu）種微生物的生長（zhǎng）需要是已知的，也可以設計一套（tào）特定環境使之特（tè）別適合這種微生物的生長，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來，盡管在混雜（zá）的微（wēi）生物群體中這（zhè）種微生（shēng）物可能隻占少數。這種（zhǒng）通過選擇培養進行微生物純培養分離（lí）的技術稱為選擇培養分離，是十分重要的，特別對於從自（zì）然界中分離、尋找有用的微生物。在自然（rán）界中（zhōng），除了（le）極（jí）特殊的情況外，在大多數場合（hé）下微生物群落是（shì）由多（duō）種微生物組成的，因（yīn）此，要從中分離出所需的（de）特定微生物是十分（fèn）困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物（wù）相比非常少時，單采用一般的平板（bǎn）稀釋方法幾乎是不（bú）可能分離到該種微（wēi）生物的。例如，若某處的土壤中（zhōng）的微生物（wù）數量在10８時（shí），必須稀釋到10-6才有可（kě）能（néng）在平板上分離到單菌（jun1）落，而如果所需的微生物的數量僅為10２-３，顯然不可能在一般通用的平板（bǎn）上得到該（gāi）微生物的單（dān）菌落。要分（fèn）離這種（zhǒng）微生物，必須根據（jù）該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，采用選擇（zé）培養分離（lí）的方（fāng）法。或抑製使大（dà）多數微生物不能生長（zhǎng），或造（zào）成有利（lì）於該菌生長的環境，經（jīng）過一定時間培養後使該菌在群落中的數量上升，再通過（guò）平板稀釋等方法對它進行純（chún）培養分離（lí）。

　　1.利用選擇平板進（jìn）行直接分離

　　主要根據待分離微生物的特點選擇不同的培養（yǎng）條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產生菌時，可以在培養基（jī）中添加牛奶或酪素製備培養基平板，微生物生長時若產生蛋白酶則（zé）會水解牛奶或酪素（sù），在平板上形成透明的蛋白質水解圈。通過菌株培養時產（chǎn）生的蛋白質水解圈（quān）對產酶菌株進行篩選，可以減（jiǎn）少工作量，將那些大量（liàng）的非產蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進行培養；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板（bǎn）上進行分離；有些微生物如螺（luó）旋體（tǐ）、粘細（xì）菌、藍細菌（jun1）等能在瓊脂（zhī）平板表麵或裏麵滑行，可以利用（yòng）它們的滑（huá）動特點進行分離純化，因為滑行（háng）能使它們自己和其它不能（néng）移動的微生物分開。可將微（wēi）生（shēng）物群落點種到平板（bǎn）上，讓微生（shēng）物滑行，從滑行前沿挑取接種（zhǒng）物接種，反複進行，得到純培養（yǎng）物。

　　2.富集培養

　　主要是（shì）指利用不同微生物間生命活動特（tè）點的不同，製（zhì）定特定的環境條件，使僅適應於該條（tiáo）件的微生物旺盛生長，從而使其（qí）在群落中的數量大大增加，人們能（néng）夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可（kě）根據所需分離的（de）微生（shēng）物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方麵（miàn）進行選擇，如溫度、pH、紫（zǐ）外線、高（gāo）壓、光照、氧氣、營養等等許多方麵。如采（cǎi）用富集方（fāng）法從土壤中（zhōng）分離（lí）能降解酚類化合物對羥基苯甲酸（suān）的微生物的實驗（yàn）過程。首先配製以對羥基苯甲酸為唯一碳源的（de）液體培養基並分裝於燒瓶中，滅菌（jun1）後將少量的土壤樣品接種於該液體培養基中，培養一（yī）定時（shí）間，原來透（tòu）明的培養液會變得渾濁，說明（míng）已有大量（liàng）微（wēi）生（shēng）物生（shēng）長（zhǎng）。取少（shǎo）量上（shàng）述培養液轉移至新鮮培養液中（zhōng）重新培養，該過程經數次重複後能利用對羥基苯（běn）甲酸的微生物的比（bǐ）例在培養物中將大（dà）大提高，將培（péi）養液塗布於以對羥基苯（běn）甲酸為唯（wéi）一碳源的瓊脂（zhī）平板（bǎn），得到的微（wēi）生物菌（jun1）落（luò）中的大部分都是能（néng）降解對羥基苯（běn）甲酸的微生物。挑（tiāo）取一部分（fèn）單菌落（luò）分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲酸的液體培養基中進行培養（yǎng），其中大（dà）部分在含有對羥基（jī）苯（běn）甲（jiǎ）酸的培養基中（zhōng）生長，而在沒有對羥基苯甲酸的培養基中表現為沒有生長，說明（míng）通過該富集程序的確得到了欲分離的目（mù）標微生物。通過富集培養使原本在自然（rán）環境中占少數的微生物的（de）數量大大提（tí）高後，可以再通過稀釋（shì）倒平板或平板劃線等操作得到純培（péi）養物。

　　富集培養是微生物學家（jiā）最強有力（lì）的技術手段之（zhī）一。營養和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應用於從（cóng）自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養（yǎng）方法提（tí）供了按（àn）照意願從自然界分離出特定已知（zhī）微（wēi）生物種類的（de）有力手（shǒu）段（duàn），隻要掌握這種微生物的特殊要（yào）求就行。富集培養法也可用來分離培養出由科學家設計的特定環境中能生長的微（wēi）生物，盡管麻豆免费视频並不知道什麽微生物能在這種特定的環境中生長（zhǎng）。

　　（五）、二元培養物

　　分離（lí）的目的通常（cháng）是要得到純培養。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難（nán）作到的。但可用二元培養物作為（wéi）純化（huà）培養的替代物。隻有一種微生物的培養物稱為純培養物，含（hán）有二種以上微生物的培養物稱為混合培養物，而如果培養物中隻含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關係的培養物稱為二元培養物。例如二元培養物是保（bǎo）存病毒的最（zuì）有效途徑（jìng），因為病毒是細胞生物（wù）的嚴格的細胞（bāo）內寄生物（wù）。有一些具有細（xì）胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內（nèi）寄生物，或特殊的共生關係。對於這些生物，二元培養（yǎng）物是在實（shí）驗室控製條件下可能達到的最接（jiē）近於純培養的培養方法（fǎ）。

　　在自然環境中（zhōng），獵食細小微生物的（de）原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養，培養物由原生動物和它獵食的微生物二（èr）者組成。例如（rú），纖（xiān）毛蟲、變（biàn）形蟲和粘菌。對這些生物，二者的關係可能並不是嚴格的。這些生物中有些能夠純培養，但是其營養要求往往（wǎng）極端複雜，製備純（chún）培養（yǎng）的培（péi）養基很困難、很費事。

　　二、微生物生長量的測（cè）定

　　微生物學研（yán）究中常常要進行微生物生長量的測（cè）定，有多種方法用於微（wēi）生物生長量（liàng）的測定，概括起來常用的有以下幾種：

　　（一）直接計數法(又稱全數法)

　　1、計（jì）數器直（zhí）接測數法

　　取定量稀釋的單細（xì）胞培養物（wù）懸液放置在血（xuè）球計數板(細胞個體形態較大的單細（xì）胞微生（shēng）物（wù），如（rú）酵（jiào）母菌等)或細菌計數板(適（shì）用於（yú）細胞個體形態較（jiào）小的細菌)上，在顯微（wēi）鏡下計數一定體積中的平均細（xì）胞數，換算出供測樣品的（de）細胞數。

　　（1）血球計數板及細胞計數

　　血球計數板是一種在特定平麵上劃有格子的特殊載片（piàn）。在劃有格子的區域中，有分別用雙線（xiàn）和單線分隔而成的方格。其中（zhōng）有以雙線為界劃成的方格25(或16)格（gé），這種以雙線為界的格子稱為中格，其內有以（yǐ）單線為界的16（或（huò）25）小格。因此，用於細胞計數的（de）區（qū）域的總小格數（shù）為：25×16=400。該400個小格排成一正方形（xíng）的大方（fāng）格，此大方格的每條邊的邊長為1 mm，故400個小（xiǎo）格（gé）的總麵積為1mm２。

　　在進行細胞計數前，先取蓋（gài）玻片蓋於計數方（fāng）格之（zhī）上，蓋玻（bō）片的下平麵與刻有（yǒu）方格的（de）血球計數板（bǎn）平麵之間留有0.1mm高度的空隙。含有細胞的供測樣品液被加注在此（cǐ）空隙中。加注在400個小格（1mm２）之上與蓋玻片之間的空（kōng）隙中的液體總體積應為：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm３

　　一般表示樣品細胞濃度的單位為：億個/mL。因此，在計數後，獲得在400個小格中的細（xì）胞總數，再乘以10４，以換算成每mL所含（hán）細胞（bāo）數。其計算公式如下：

　　菌液的含菌數/mL=每（měi）小格平均菌數（shù）×400×10 000×稀（xī）釋倍數

　　在進行具體操作時，一般取五個中（zhōng）格進行計數，取格的（de）方法一般有兩種：①取（qǔ）計數板斜角線相連的5個中格；②取（qǔ）計數（shù）板4個角上的4個中格和計數板正中央的1個中格。對橫跨（kuà）位於方格邊線上的細胞，在計數（shù）時，隻計一個方格4條邊中的2條邊線上的細胞，而另兩條邊線上的細胞（bāo）則不計；取邊的原則是每個方格均取上邊線與右邊線或（huò）下邊線與左邊線。

　　圖3—5血球計（jì）數板方格示意圖

　　（2）細菌計數板及細胞計數

　　細菌計數板與血球計數板結構大同小異，隻是刻（kè）有格子的計數板平麵與蓋（gài）玻（bō）片之間的空隙高度（dù）僅0.02mm。因此，計算方法稍有差異（見以下（xià）計算（suàn）公式），餘者與血球計數板法同（tóng）。

　　菌液樣（yàng）本的含菌數/mL=每小格平均菌數×400×50 000×稀釋（shì）倍數

　　2、塗（tú）片染色計數

　　用計數板附帶的0.01mL吸管，吸取定量稀釋的細菌懸液，放（fàng）置刻有1 cm２麵積的玻（bō）片（piàn）上，使（shǐ）菌液（yè）均勻地塗布在1cm２麵積上，固（gù）定後染色，在顯（xiǎn）微鏡下任意選擇幾個乃至十幾個視野來計算細胞數量。根據計算出的視野麵積核算出每1cm２中的菌（jun1）數，然後按1cm２麵（miàn）積（jī）上的菌液量和稀釋度，計算每mL原液中的含菌數。

　　原菌液的含菌數/mL=視野中的平均菌數×1cm２/視野（yě）麵積（jī）×100×稀釋倍數

　　3、比濁法

　　這是測定菌懸液中細胞（bāo）數量的快速方法。其原理是菌（jun1）懸（xuán）液中的單細胞微生物，其細胞（bāo）濃度與混濁度成正比，與透光度成反比。細（xì）胞越多，濁度越大，透光量越少。因此，測定菌懸液的光密度(或透（tòu）光度)或濁度可（kě）以反映細胞的濃度。將未知細胞數（shù）的懸液與已知細（xì）胞數（shù）的菌懸液相比（bǐ），求出未知菌懸液所含的細胞數。濁（zhuó）度計、分光光度儀是測定菌懸（xuán）液細胞濃度（dù）的常用儀器。此法比較簡便，但使用（yòng）有局限性。菌（jun1）懸液顏色不宜太深，不能混雜其他物質，否則不能獲得正（zhèng）確結果。一般在用此法測定細（xì）胞濃度時，應先用計數法作（zuò）對應計數，取得經驗數據，並製作菌數對（duì）OD值的（de）標準曲線方便查獲菌數值。

　　（二）活菌計數法(又叫間接計數法)

　　活菌計數（shù）法又稱間接（jiē）計（jì）數法。直接計數法測定到的是死、活細胞總數，而間接計數法測得的僅是活菌數。這類方法（fǎ）所得的（de）數值往往比（bǐ）直接計數法測得的數值小。

　　1、平板（bǎn）菌（jun1）落計（jì）數

　　此（cǐ）法是基於每一個分散的活細胞在適宜的培養基（jī）中具有生長繁殖並能（néng）形成一個菌（jun1）落（luò）的能力（lì）；因此，菌落數就是待測樣品（pǐn）所含的活菌數。

　　將單細胞微生物待測液經10倍係列稀（xī）釋（shì）後，將（jiāng）一定濃度的稀（xī）釋液定量地（dì）接種到瓊脂平板培養基上培養（yǎng），長出的菌落數（shù）就是（shì）稀釋（shì）液中含有的活細胞數，可以計算出供測（cè）樣品中的活細胞數。但（dàn）應注意，由於各種原因，平板上的單個菌落（luò）可能並不（bú）是（shì）由一個（gè）菌體細胞（bāo）形成的，因（yīn）此在表達單位樣品含菌數時，可用單位樣品中形成菌落單位來表示，即CFU／mL或CFU／g(CFU即colony-forming unit)。

　　2、液體稀釋最大或然數法測數

　　取定量（1mL）的（de）單細胞微生物懸液（yè），用培（péi）養液作（zuò）定量10倍係列稀釋，重複3－5次，將不同（tóng）稀釋度的係列稀釋管置適（shì）宜溫度下（xià）培養。在稀釋度合適的（de）前提下，在（zài）菌濃度相對較高的稀釋管內均出現菌生長（zhǎng），而自某個稀釋度較高的稀釋管開始至稀釋度更高的稀（xī）釋管中均不出現（xiàn）菌生長，按稀釋度自低到高的順序，把最後三個稀釋度（dù）相對較高的、出現菌生長的稀（xī）釋管之稀釋度稱（chēng）為臨界級數。由（yóu）3至5次重複的連續三級臨界級數獲得指數，查（chá）相應重複的最大（dà）或（huò）然數(即most probable number，MPN)表求得最大（dà）可能數，再乘以出現生長的（de）臨界級數的最低（dī）稀（xī）釋（shì）度，即可測得比（bǐ）較可靠的樣（yàng）品活菌濃度。

　　在實（shí）踐中（zhōng），通（tōng）常以5管重複為一個組，故這裏僅列（liè）出5次重複測數統計表。隻（zhī）要知道了數量指標，就可查知（zhī）近似值。

　　3薄膜過濾計數法

　　測定水與空（kōng）氣中的活菌數量時，由（yóu）於含菌濃度低，則使用微（wēi）生物限度檢測儀（yí）可先（xiān）將待測樣品(一定（dìng）體積的（de）水或空氣)通過微（wēi）孔（kǒng）薄膜(如（rú）硝化纖維薄膜)過濾濃縮，然後把濾膜放在適當（dāng）的固體培養基上培養，長（zhǎng）出菌落後即可（kě）計數。

　　（三）細胞物質量測定法

　　1、幹重法

　　集菌儀過濾定量培養物用離心或過濾的方法將菌體從培養基中分離出來（lái），洗淨、經常（cháng）壓（yā）或真空幹燥，幹燥溫度常采用105℃、100℃或紅外線烘幹至恒重，也可在較低（dī）溫度（80℃或40℃）下（xià）真空幹（gàn）燥，然（rán）後精確稱重，即可（kě）計算出培養物的總生（shēng）物量。過濾時絲狀真菌用濾紙過（guò）濾，細菌用醋酸纖（xiān）維膜等進行過濾。一般細（xì）菌幹重約為濕重的20％～25％。此法直（zhí）接而又可靠，但要求測定時菌體濃度較高，樣品中不含非菌（jun1）體的幹物（wù）質（zhì）。

　　2、含氮量測定法（fǎ）

　　細（xì）胞的蛋白質含量是比較穩（wěn）定的，可以（yǐ）從蛋白質含量的測定求出細胞物質量。已知（zhī）細菌細胞幹重的含氮量（liàng）一般為12%～15％，酵母（mǔ）菌為7.5％，黴菌為6.0％。一般細菌的含氮量約為原生質幹重（chóng）的（de）14％。而總氮量與（yǔ）細胞蛋白質總含量的關係可用下式（shì）計算（suàn）：

　　蛋白質總量=含氮量百分比×6.25

　　3、DNA測定法

　　這種方法是基於DNA與DABA—2HCl(即新配製的20％W／W，3,5—二氨（ān）基苯甲酸-鹽酸溶液)結合能顯示特（tè）殊熒光反應的原理，定量測定培養（yǎng）物的菌懸液的熒光反應強度，求得DNA的含量，可以直接反映所含細胞物質的量。同時還可根（gēn）據DNA含量（liàng）計算出細菌的數量。每個細菌平均含8.4×10－５ng DNA。

　　4、其（qí）他生理指標測定法

　　微生物新陳代謝的（de）結果，必（bì）然要消耗或產生一定量的物質。因此也可以用某物質的消耗量或某產物的形成量來表示微生物的生（shēng）長量（liàng）。例如通過測定微生（shēng）物對氧的吸收、發酵糖產酸量或CO２的釋放量，均可用（yòng）來作為生長指標。使用這一方法（fǎ）時，必須注意作為生長指標的那些生理活動，應不受外界其他因素的影響或幹擾，以便獲得準確的結果。

　　從上表中可以看出，每種方法都各有優點和局限性。隻有在考慮了（le）這些（xiē）因素同需要著手解決的問題之間的關係以後，才能對具體的方法進行選擇。正如前麵說過的（de），平皿菌落計數法是（shì）微生物學中應（yīng）用最多的常規方法，掌握這一方法的原理和實際操作，很（hěn）有必要（yào）。此（cǐ）法在理論上（shàng）能反映活（huó）菌數。另外當用（yòng）兩種不同的方法（fǎ）測量細菌的生長量時，其結果不一（yī）致是完全可（kě）能的。

　　測定微生物的生長量，在理論和實踐上都十分重要。當（dāng）麻豆免费视频要對細菌在不同培養基中或不同條（tiáo）件下的生長情況進行評價或解（jiě）釋時，就必須用數量來表示它的生長。例如可以通過細菌生長的快慢來判（pàn）斷某一條件是否（fǒu）適合。生長快的細胞，最終的（de）總收獲量可能沒有另一些條件下的收獲量大。在另（lìng）一些條件下，生長速率雖然較低，但它卻（què）可（kě）在一段時間內不斷（duàn）增加。因此，隻有具備了有（yǒu）關生長的定量知識，才能在實際應用（yòng）中作出正確的選擇，以利於科研和生產活（huó）動的進一步開展。